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Aug 24, 2023

再利用可能なフェイスマスクの潜在的な抗ウイルス剤としての布地への塩コーティングの in vitro 試験

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17041 (2022) この記事を引用

1039 アクセス

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

新型コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミック中、ほとんどの国で公共の場でのマスク着用が義務化されました。 初期の懸念事項の 1 つであったフェイスマスクを取り扱う際の自己汚染のリスクは、マスクに抗ウイルスコーティングを施すことで軽減できます。 本研究では、家庭環境に適応した技術を使用して、再利用可能な布マスクの製造に適した布地に付着させた塩化ナトリウムの抗ウイルス効果を評価しました。 スプレーと浸漬の両方の方法と 3 つの塩希釈を含む 8 つのコーティング条件をテストしました。 インフルエンザ A H3N2 ウイルス粒子を塩でコーティングされた材料上で直接インキュベートし、収集し、ヒト 3D 気道上皮培養物に添加しました。 上皮における生きたウイルスの複製を、収集した頂端洗浄液中で経時的に定量した。 コーティングされていない材料と比較して、4.3 mg/cm2 以上の塩の堆積により、ウイルスの複製が著しく減少しました。 ただし、塩の量が多い場合でも、コーティングの有効性は結晶のサイズと分布に依存し、さらにコーティング技術に依存していました。 これらの発見は、布マスクの抗ウイルス保護として塩コーティングが適切であることを裏付けるものですが、消費者向けソリューションを開発する際にはコーティングプロトコルに特別な注意を払う必要があることも強調しています。

コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミックに対応し、世界保健機関1の勧告に従い、ほ​​とんどの国が重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の一般的な感染を制御するための戦略とガイドラインを開発しました。人口。 ガイドラインでは、社会的距離の確保に加えて、公共の場所でのフェイスマスク(使い捨てまたは再利用可能)の使用を奨励または義務付けています2。 これにより、呼吸器疾患の感染を抑制するために一般の人々がフェイスマスクを広く使用するようになりました。 自家製か市販かにかかわらず、非医療用の再利用可能な布製フェイスマスク 3 の使用は、使い捨てフェイスマスクの初期不足に対する解決策として受け入れられており 4、確立された公衆衛生ガイドラインの持続可能性を高める可能性があるとすぐに認識されました。 。 再利用可能なフェイスマスクがウイルス感染から保護できるかどうかは、直径 1 ~ 3 μm の粒子の濾過性能に依存します 5,6。これはマスクの製造に使用される材料によって大きく異なります 7、8、9、10、11。 3 μm を超えると、ほとんどの一般的な繊維製品の濾過効率は通常 100% となり、マスクと接触する可能性のある直径 > 3 μm の粒子を効果的にブロックします。 このサイズの粒子は大量のウイルスを運ぶ可能性があるため 12、マスクの表面を抗ウイルス剤でコーティングすると、媒介物の伝染を軽減できる可能性があります。

新型コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミックの初期段階では、自己汚染のリスクに関する懸念1があり、自己汚染によってマスク使用のメリットが相殺されるのではないかという懸念から、訓練を受けていない一般の人々がマスクを着用すべきかどうかについての議論が活発化した13。 これに関連して、科学界はマスクの着用を強く主張し 14、15、これは研究 16、17 と数学的モデル 18、19 によって裏付けられました。 したがって、マスク表面を抗ウイルス剤でコーティングすると、呼吸器ウイルスの間接的な感染を減らすのに役立つ可能性があります20、21、22。 金属および金属酸化物、抗菌ポリマー、光反応性または炭素由来の材料、および生体分子は、抗ウイルスマスクコーティングとして考慮されており 23、24、25、26、27 、広範囲に検討されています 13、28、29。 Quan et al.20 は、不織布 (メルトブローン) ポリプロピレン製の外科用フェイスマスクを塩化ナトリウム (NaCl) でコーティングする簡単な方法を説明しました。 彼らは、H1N1 インフルエンザウイルス粒子は、ウイルスを含んだエアロゾルで湿ったときのコーティングされた塩の局所的溶解と再結晶化により、5 分以内にカプシドの物理的破壊によって不活化されると報告しました 20,30。 このコーティングは安定しており、過酷な条件で保管した後でもその有効性が維持されました20。 著者らは後に、塩コーティングが不活性膜を機能化して、浮遊病原体を効率的に捕捉し、不活化することを実証しました 31。 抗ウイルスコーティングに使用する場合、NaCl は安全で安価で入手が容易であり、専門家以外の環境でも自家製および市販の再利用可能なフェイスマスクの製造に使用できます。

本研究の目的は、Quan et al.20 が報告した、一般的な布地で作られた再利用可能なフェイスマスクのコーティング用の塩溶液配合をさらに評価することでした。 布製フェイスマスクは再利用するために定期的に洗濯されるため、ユーザーは洗濯のたびに抗ウイルス塩コーティングを塗り替える必要があります。 したがって、家庭での使用に適した塩の堆積方法、つまりスプレーと浸漬、および再利用可能なフェイスマスクの製造に推奨される一般的な生地10が、堆積した塩の層の抗ウイルス特性に影響を与えるかどうかを調査しました。

私たちは、家庭用の万能クリーニング クロスをテスト ファブリックとして選択し、自動制御されたスプレーまたは浸漬塗布によって段階的な濃度の塩をコーティングしました。 ウイルスに暴露する前のコーティング条件を特徴付けるために、堆積した塩の量、結晶サイズと分布を評価しました。 コーティングの抗ウイルス特性は、三次元 (3D) 肺上皮組織で培養したインフルエンザ A H3N2 ウイルス (A/H3N2、オルソミクソウイルス科、アルファインフルエンザウイルス属、種インフルエンザ A ウイルス、血清型 H3N2) を使用した in vitro バイオアッセイによって試験および比較されました。文化モデル。

5 つのスプレー コーティング条件と 3 つの浸漬コーティング条件が定義されました。 湿潤剤 20 として Tween-20 を含む塩配合物によるスプレー塗布を、任意のストローク単位 1、3、5、および 10 に従ってバルブ開口部が変更されたスプレー装置 (Spr S1 と表示) を使用して、条件ごとに 1 枚の生地で実行しました。 、Spr S3、Spr S5、およびSpr S10をそれぞれ含む。 ストロークユニット 3 (Spr S3 Dil5 ×) を使用した追加サンプル用に、スプレー配合物を 5 倍に希釈しました。 無希釈(Dip No Dil)、5 倍(Dip Dil5 ×)、10 倍希釈(Dip Dil10 ×)の各条件で 3 枚の材料に浸漬コーティングを実行しました。 ウイルス粒子に曝露する前に、布地に堆積した塩の量(mg/cm2)、塩の結晶の分布およびサイズを測定して、各コーティング条件を特徴付けました。

スプレーおよび浸漬コーティング法では、適用されるストローク単位または浸漬溶液の塩濃度の希釈に比べて、布地に堆積する塩が直線的に増加しました(図 1)。

スプレーおよび浸漬コーティングされた布地に付着した塩 (塩化ナトリウム、NaCl) 濃度。 Spr 処理では、単一の材料 (42.25 cm2) を用意し、そこから 3 つの材料 (1 cm2 の複製) を切り出しました。 浸漬処理のために、3 つのサンプル (7.5 cm2) を別々に準備しました。 (a) ストローク単位 1、3、5、および 10 のスプレー コーティング。回帰直線式: Y = 2.0805x − 2.076; R2 = 0.9774; R = 0.9886; P<0.05。 (b) 10 倍、5 倍に希釈した食塩水、または無希釈で浸漬コーティングします。 データは平均値 ± 標準偏差です。 回帰直線式: Y = 45.256x + 0.3492; R2 = 0.9968; R = 0.9984; P < 0.0001。 計量された塩分濃度は、平方センチメートルあたりのミリグラムで表示されます。

試験材料の走査型電子顕微鏡写真 (図 2) は、堆積と蒸発に続いて、スプレーコーティングと浸漬コーティングの両方の方法で布地の繊維に沿って結晶が分散して散乱したことを示しています。

スプレーおよび浸漬法により塩コーティングされた試験材料の走査型電子顕微鏡画像。 塩配合物は、希釈せずに、または希釈して使用した。 スプレー処理では、任意のストローク単位に従ってスプレー装置のバルブ開口部を変化させることにより、増加する量の塩の堆積が可能になりました。 (a) コーティングなし、(b) スプレー、原塩製剤、ストロークユニット 1 (Spr S1)、(c) スプレー、5 倍希釈塩製剤、ストロークユニット 3 (Spr S3 Dil5 ×)、(d) スプレー、原液塩製剤、ストロークユニット 3 (Spr S3)、(e) スプレー、希釈されていない塩製剤、ストロークユニット 5 (Spr S5)、(f) スプレー、希釈されていない塩製剤、ストロークユニット 10 (Spr S10)。 浸漬処理では、試験材料を、(g) 10 倍希釈 (Dip Dil10 ×)、(h) 5 倍希釈 (Dip Dil5 ×)、および (i) 未希釈 (Dip No Dil) 塩配合物に浸漬しました。 画像上の矢印は、試験材料で見つかった塩の結晶と凝集体の例を指します。

結晶サイズは、スプレーコーティング法の場合はスプレー流量、ディップコーティング法の場合はディップ液の希釈率により決定した。 スプレーコーティング法では、流量が低いと小さな単分散結晶が生成しますが、流量が高いと布地表面に堆積した合体液体の乾燥後により大きな多分散結晶が形成されます。

コーティングされていないサンプル (図 2a) と、堆積量が最も少ないサンプルである Spr S1 (図 2b) および Spr S3 Dil5 × (より多くの量で噴霧されたが、塩濃度は低かった; 図 2c) は、似たような外観。 Spr S1 および Spr S3 Dil5 × サンプルの繊維上に散在する塩の結晶はほとんど観察されませんでした。 ただし、走査型電子顕微鏡(SEM)では見えませんが、エネルギー分散型X線分光法(EDX)で確認されたように、Spr S1およびSpr S3 Dil5×サンプルの繊維上に塩の結晶が存在していました(補足図S1aおよびb)。 、 それぞれ)。 中程度の噴霧量、Spr S3 および Spr S5 では、塩の結晶が走査型電子顕微鏡写真でよりはっきりと見えました。 それらは、Spr S5サンプルよりもSpr S3サンプルでより明確に、繊維に沿って小さな凝集体を形成しました(それぞれ図2d、e)。 最大の噴霧量、つまりSpr S10サンプル(図2f)では、いくつかの繊維を包み込む大きな結晶が形成されました。 Spr S3、Spr S5、およびSpr S10のサンプルでは、​​SEMで観察された大きな結晶に加えて、EDXで明らかになったように、小さな塩の結晶が材料全体の繊維に沿って分布していました(補足図S1c〜e)。

ディップコーティング法では、希釈溶液(Dip Dil10 × および Dip Dil5 ×)と非希釈溶液(Dip No Dil)の両方(それぞれ図 2g-i)により、繊維を覆う塩の結晶が形成されました。 スプレーされた試験サンプルと同様に、浸漬コーティングされた繊維上の平均結晶サイズは、溶液中の塩濃度によって変化しました。 Dip Dil10 × サンプルは中程度の大きさの塩の結晶を示しましたが (図 2g)、Dip No Dil サンプルは繊維を完全に覆う非常に大きな塩の結晶によって特徴付けられました (図 2i)。 塩で厚くコーティングされた試験材料、すなわち、Spr S10 および Dip No Dil サンプルは、取り扱い中に非常に硬くなりました。 このような硬化は、より低い塩濃度では観察されなかった。

コーティングされたサンプルと直接接触した後、ウイルス粒子が収集され、MUCILAIR ヒト気道上皮細胞培養インサートへの接種に使用されました。 1% Tween-20/水溶液をスプレーコーティングした布地サンプルを使用して、ストローク 3、5、および 10 (Tween Str3、Tween Str5、および Tween Str10) で同じプロトコルを実行しました。 ウイルス感染の過程における上皮の完全性は、未処理の非感染培養物(モック)および直接感染した培養物(マスクなし)と比較して経上皮抵抗性(TEER)を測定することによってモニタリングされました。 TEER は上皮の完全性を反映する動的かつ非侵襲的な測定値であり、通常、損傷のない MUCILAIR 培養物では 200 ~ 600 Ω・cm2 の範囲になります 32。 細胞結合の破壊と上皮の穴の存在により、TEER 値は 100 Ω・cm2 未満になります。

ウイルス感染から 24 時間後、すべての MUCILAIR 上皮は、模擬対照の TEER 値と同等の TEER 値を示しました (図 3)。 感染後 72 時間 (hpi) で、マスクなし対照条件下では TEER 値が 100 Ω・cm2 未満に減少し、激しいウイルス複製による上皮構造の深刻な破壊が示されました。 平均して、処理された試験材料とのインキュベーション後に収集されたウイルスを接種されたすべての培養物は、模擬対照の値と同等のTEER値を保持した。 しかし、最低濃度の塩(Spr S1 および Spr S3Dil5 ×)および Tween-20(Tween Str3 および Tween Str5)を含む試験条件下では、各処理グループの 1 つの複製培養物の TEER 値は 100 Ω・cm2 未満でした。 対照的に、より高い塩濃度と Tween-20 濃度の試験条件では、すべての複製培養物が模擬対照の TEER 値と同様の TEER 値を示しました。 144 hpi では、試験条件に関係なく、すべての培養物において組織の完全性がウイルス感染によって深刻な影響を受けました。

感染後 24、72、および 144 時間における MUCILAIR 上皮の経上皮電気抵抗 (TEER) 測定。 平均値±標準誤差が表示されます。 コーティングされていないサンプル (n = 5) を除き、すべての処理で n = 3。 点線は、組織の完全性の 100 Ω・cm2 限界を表します。 模擬、非感染、未処理の対照培養。 Triton X-100 洗剤をポジティブコントロールとして使用します。

細胞内でのウイルス複製の比較分析は、感染後 24 時間と 72 時間でしか実行できませんでした。 ウイルスゲノムのコピーは、24 時間前にはどのサンプルでも検出できませんでした。 72 hpi を超えると、マスクなしの対照条件では細胞内のウイルス複製が著しく減少し、コーティングされていないサンプルではプラトーに達し、この上皮系で以前に遭遇したように、処理間の比較に偏りが生じました (データは示されていません)。

24 hpi で、マスクなし対照および最も低い塩 (Spr S1、Spr S3Dil5 ×、および Spr S3) および Tween-20 濃度 (Tween) で処理したサンプルから収集した細胞頂端洗浄液でウイルスゲノムのコピーを検出および定量することができました。 Str3 および Tween Str5)、他のサンプルからはそうではありません(図 4a、c)。

非コーティング試験材料またはさまざまな濃度でコーティングされた試験材料とウイルスとの直接接触後に感染したMUCILAIR上皮の頂端培地におけるA/H3N2ウイルスゲノムコピー(gc)数を決定するためのTAQMAN逆転写ポリメラーゼ連鎖反応塩またはトゥイーン。 (a) 塩コーティング、感染後 24 時間および 72 時間で定量化された log10 A/H3N2 gc 数/mL。 (b) 塩コーティング、感染後 72 時間のウイルス複製。 (c) トゥイーンコーティング、感染後 24 時間および 72 時間で定量化された log10 A/H3N2 gc 数/mL。 (d) トゥイーンコーティング、感染後 72 時間のウイルス複製。 データは、感染非コーティング処理群で定量化されたlog10A/H3N2ウイルスgc数/mLの平均に対するパーセンテージとして表され、100%に正規化されている。 平均値±標準誤差が表示されます。 非コーティング (n = 5) を除くすべての処理で n = 3。 *P < 0.05。

感染から 72 時間後、すべてのコーティング処理グループの頂端洗浄液からウイルスが検出されました。 しかし、コーティングなし(非コーティング)を含むすべての処理は、感染対照培養物と比較した場合の細胞培養頂端洗浄液中のウイルスゲノムコピー数の減少に反映されるように、ウイルス複製に影響を及ぼした(マスクなし対照、図2)。 .4b)。 非コーティング条件と比較して、Spr S3、Spr S10、Dip No Dil、および Dip Dil10 × 処理下の塩コーティングは、追加の顕著な抗ウイルス効果を発揮しました。これは、Spr S3 (P = 0.0269) および Dip No Dil (P = 0.0454)。 A/H3N2 ゲノム コピー数が最も低かったのは、Spr S3 および Dip No Dil 培養物から収集した頂端洗浄液であり、感染した非感染者と比較してゲノム コピー数が log10 でそれぞれ 4.31 および 3.95 減少したことが示されました。コーティングされた処理培養物。 統計的に有意ではありませんが、Spr S10、Dip Dil 5×、Dip Dil 処理下でのウイルス複製の減少は依然として顕著であり、log10 の減少はそれぞれ 3.5、2.99、および 3.65 でした。 コーティング中の塩濃度とウイルスゲノムコピーレベルの間に明確な相関関係は観察されませんでした。塩濃度がそれぞれ 4.73 mg/cm2 および 45.54 mg/cm2 の Spr S3 サンプルと Dip No Dil サンプルで最良の結果が得られたためです。 関連する抗ウイルス活性は、材料表面上の塩の堆積の一定の閾値を超えると達成されるようです。 Spr S5 処理はこの観察の唯一の例外であり、ゲノム コピー数のより顕著な減少をもたらすことが期待できました。 それにも関わらず、3 つの複製のうち 2 つは、ゲノム コピー数において 3.74 および 3.54 の顕著な log10 減少を示しましたが、ウイルス複製に影響を示さなかったのは 1 つの複製だけでした。

Tween-20試験条件(図4c、d)では、最高濃度のTween-20、つまりTween Str10処理のみがウイルス複製に顕著な影響を及ぼし、それらと比較してゲノムコピー数のlog10が3.57減少しました。コーティングされていない試験サンプルの。

細胞頂端洗浄液中のウイルスゲノムコピーの定量化は、ウイルス粒子の潜在的な感染力の完全な指標ではない可能性があるため、細胞ベースの分析を実行することにより、選択した試験条件に対する50%組織感染量(TCID50)を決定しました(図5)。ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(MDCK-SIAT1)をコードするcDNAをトランスフェクトしたMadin-Darbyイヌ腎細胞におけるウイルス力価測定。

コーティングされていない試験材料または様々な濃度の塩でコーティングされた試験材料とウイルスとの直接接触後に感染したMUCILAIR上皮の頂端培地におけるA/H3N2ウイルス力価を、感染後72時間で測定した。 データは、感染非コーティング治療群におけるlog10 TCID50/mLの平均に対するパーセンテージとして表されており、100%に正規化されている。 平均値±標準誤差が表示されます。 n = 3。 **P < 0.01; ***P < 0.001。

ゲノムコピー数に関して以前に観察されたように、ウイルス力価は、試験条件Spr S3 (P = 0.000752)、およびSpr S10 (P = 0.00318)およびDip Dil 10 × (P = 0.000856)の条件下では、非試験条件下に比べて有意に低かった。 - コーティングされたテスト状態。 TCID50 アッセイの結果は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) によって得られた結果と一致しており、ウイルスとの 10 分間の直接接触後に生存および複製できるウイルス粒子の数が顕著に減少していることが示されました。塩でコーティングされた生地。

ウイルス粒子を収集するために、接種された試験物質を細胞培地中で 5 分間インキュベートしました。 ウイルスを含む溶液は細胞感染前に細胞培地で1:10に希釈されましたが、ほとんどの細胞サンプルでは塩分が依然として等張性を超えており(補足表S1)、細胞へのウイルスの浸透に影響を与えた可能性があります。 ウイルスの不活化がウイルス粒子と塩コーティングされた布地との直接接触のみによるものであり、収集ステップやMUCILAIR上皮接種段階では起こらなかったことを検証するために、A/H3N2ウイルス粒子を0.9%、3.5%の濃度でインキュベートしました。 %、および 35% 食塩水。 ウイルス感染力は処理の影響を受けず、すべての試験条件下で、ウイルスゲノムコピーは24 hpiという早さで定量化できました(図6a)。

高張塩溶液中でのウイルスプレインキュベーションが細胞内でのウイルス複製に及ぼす影響。 ( a )さまざまな濃度の塩溶液中でウイルスをインキュベートした後、感染したMUCILAIR上皮の頂端培地におけるA / H3N2ウイルスゲノムコピー(gc)を決定するためのTAQMAN逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 データはlog10A/H3N2 gc数/mLとして表され、感染後24時間および72時間で定量化されます。 平均値±標準誤差が表示されます。 n = 3。(b) 感染後 24、72、および 144 時間後の MUCILAIR 上皮における経上皮電気抵抗 (TEER) 測定。 平均値±標準誤差が表示されます。 n = 3。点線は、組織の完全性の 100 Ω・cm2 限界を表します。 模擬、非感染、未処理の対照培養。 Triton X-100、洗剤はポジティブコントロールとして使用されます。

72 hpi では、対照培地と同様に、3 つの生理食塩水試験条件においてゲノムコピー数が log10 係数 2 ~ 3 増加しました。 TEER の結果は、生理食塩水治療がウイルス感染の制御に効果がないことを裏付けました。 対照媒体と同様に、3 つの生理食塩水試験グループでは、TEER 値は 72 hpi という早い時点で 100 Ω・cm2 未満に低下しました (図 6b)。 すべてのサンプルにおいて、ウイルスを飽和食塩水(生理食塩水 35%)中で 10 分間インキュベートした後でも、ウイルスの広範な複製により上皮の完全性が急速に破壊されました。

本研究は、優れた粒子濾過特性を有し、洗浄して再利用可能なフェイスマスクに組み込むことができる材料に関するQuan et al.20の発見を拡張したものである10。 さらに、家庭環境に適用できる塩コーティング技術を使用しました。 最後に、我々は、ヒトの非改変 3D 気道上皮において、簡単な実験室環境で塩コーティングの抗ウイルス特性を検証しました 33,34。 この試験モデルは、さまざまな素材上の他のタイプの抗ウイルス コーティングに適用できる可能性があります。

スプレーと浸漬コーティングという 2 つの塩の堆積方法により、布地の表面に結晶が形成され、塩の結晶のサイズは希釈と体積に依存します。 最も低濃度のコーティング条件であるSpr S1およびSpr S3 Dil5 × を除き、塩は布地サンプル上に十分に分布していましたが効果がありませんでしたが、他のすべてのテスト条件では、塩の堆積がウイルス活性に明らかな影響を及ぼしました。 これらのサンプルでは、​​ウイルスゲノムのコピー数が非常に低かったか、24 hpi では検出できませんでした。 ウイルス複製は、5 つの試験条件、すなわち、Spr S3、Spr S10、Dip No Dil、Dip Dil5 ×、および Dip Dil10 × において、依然として 3 ~ 4 log10 72 hpi 減少しました。 これらの結果は、塩でコーティングされた布地と直接接触した後に細胞に感染できるウイルス粒子が減少することを示す TCID50 アッセイ結果によって確認されました。 これらの発見は、サージカルマスクの内側フィルターへの塩の堆積とその後のインフルエンザA/H1N1ウイルスの接種20、およびサージカルマスクの外層への塩噴霧とその後のブタウイルスの接種の影響を実証した以前の研究の結果と一致しています。 (伝染性胃腸炎ウイルス)35. しかし、生地上の塩濃度と細胞培養中のウイルスゲノムのコピー数の間には明確な負の相関関係はありませんでした。 ウイルス粒子の最も強い減少は、2 つの非常に異なる塩コーティング濃度、Spr S3 (4.73 mg/cm2) および Dip No Dil (45.54 mg/cm2) で観察されました。 この範囲の他のコーティング条件では、ウイルスの複製はより低いレベルで抑制されましたが、それでもウイルス量は log10 係数 3 で減少しました。対照的に、Spr S1 (0.58 mg/cm2) および Spr S3 Dil5 × (0.41 mg/cm2) 処理は、ウイルスの複製を制御するには明らかに不十分であり、ウイルスの複製を阻害するには閾値の塩濃度が必要であると考えられます。 ここで、Quan et al.20 によって報告された沈着塩の有効量は 6.16 mg/cm2 ~ 24,64 mg/cm2 であり、これは我々の活性サンプルに沈着した塩の量の範囲内に十分入っていることに注意する必要があります。

塩コーティングの抗ウイルス効果は、局所的な塩の溶解とそれに続く再結晶化によるウイルスキャプシドの破壊の結果であると考えられます20,30。 この効果は、コーティングに含まれる塩の量だけでなく、布地上の塩の結晶の分布とサイズによっても変化する可能性があり、これらはさまざまな塩の堆積パラメータや技術によっても異なります。 これは、この研究で観察された、布地上の塩濃度と、特定の塩濃度閾値を超えるウイルス不活化との間の不十分な負の相関関係を説明する可能性がある。

塩の溶解/再結晶仮説と並行して、空中浮遊微生物について以前に示されたように、ウイルス収集ステップ中に溶解した塩残留物も培地の高張性のためにウイルス不活化に寄与した可能性がある可能性を検討しました35。 この仮説を検証するために、A/H3N2 ウイルス粒子を MUCILAIR 細胞培養物に接種する前に、等張性から飽和までさまざまな塩濃度の溶液中で直接インキュベートしました。 その結果、生理食塩水は時間の経過とともにウイルス複製に影響を及ぼさず、対照培地と比較して上皮細胞の完全性(TEER)の保持に寄与しないことが明らかになりました。 布地コーティング実験では、ウイルス収集ステップの塩濃度は、明らかにテストされた食塩水の範囲内でした(コーティングでは0.95〜5.46%、食塩水では0.90〜17.9%;補足表S1)。 同様に、SARS-CoV-2 を含む試験系では、ウイルスを最大 1.7% の生理食塩水とプレインキュベートしても、Vero 細胞でのウイルス複製は変化せず 36、A/H3N2 ウイルスを 1 M (5.8%) NaCl でインキュベートしても変化しませんでした。この溶液を最長 1 時間使用しても、リン酸緩衝生理食塩水対照と比較して、MDCK-SIAT1 細胞の血球凝集素力価およびプラーク形成単位は減少しませんでした 37。 これらの結果は、Rubino et al.30 によって最近実証されたように、コーティングされた布地上でのウイルス粒子のインキュベーションのみがウイルス不活化の原因であることを確認しました。 不活化効果は、塩化カリウム (KCl)、硫酸カリウム (K2SO4)30、リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4)37 などの他の塩のように、使用される塩の種類ではなく、塩の結晶形成特性に起因すると考えられます。サージカルマスクにコーティングすると同様の効果が得られることが示されています。

塩の溶解/再結晶による機械的なキャプシドの破壊に加えて、塩の再結晶中の浸透圧の増加がウイルスのキャプシドの変形と損傷を引き起こし、不活性化を引き起こすことが示唆されています 20,30,38。

塩溶液には 1% の Tween-20 が含まれていたため、この界面活性剤がウイルスの不活化にも役割を果たしている可能性があるかどうかを調査しました。 Tween-20 は、脂質とタンパク質の相互作用を破壊し、膜を可溶化することができる穏やかな界面活性剤 39 であるため、脂質膜に埋め込まれたタンパク質の集合体であるインフルエンザ A ウイルスのキャプシドに影響を与える可能性があります 40。 本研究では、ソルトコーティング法でも使用されるストロークサイズに基づく 3 つのスプレー濃度、つまりストローク 3、5、および 10 をテストしました。 Tween Str10 処理における最高濃度の Tween-20 のみが、MUCILAIR 細胞におけるウイルス複製に顕著な影響を及ぼし、log10 の減少は 3.57 でした。 これは、塩濃度が最も高いサンプルでは Tween-20 もウイルス不活化に寄与している可能性があることを示しています。 これと一致して、Tween-20 は 1%41 または 0.25%42 の濃度でヘルペスウイルスの生存率を低下させることが報告されました。

これらの技術的考察に関係なく、本研究の結果は、塩がサージカルマスクだけでなく、洗える布マスクに使用できる家庭用材料にも抗ウイルス保護バリアを形成できることを裏付けています。 塩の抗ウイルス効果はウイルスカプシドの物理的破壊によって引き起こされたため、SARS-CoV-2などの他のエンベロープウイルスは、たとえA/Aと密接な関係がなくても、同様に効率的に影響を受ける可能性があると考えるのが合理的です。 H3N2。 キャプシドの変化に関連するこの交差特異的抗ウイルス活性は、クランベリー抽出物でコーティングされたスパンレース不織布との接触後の SARS-CoV-2 (ポジティブセンス一本鎖 RNA) およびバクテリオファージ phi6 (二本鎖 DNA) で報告されています 26。 インフルエンザ A/H3N2 と MUCILAIR ヒト鼻上皮を使用した現在のモデルは、バイオセーフティ レベル 2 (BSL-2) のみを必要とするため、幅広い施設で導入できますが、SARS-CoV-2 を使用するには BSL-3 が必要です。 ヒトの鼻上皮を使用するこのモデルは、ウイルスと抗ウイルスコーティングの間の相互作用が単純化しすぎている可能性があること、および肯定的な結果がエアロゾル化したウイルス粒子を含む、より洗練されたシステム。

再利用可能な布製フェイスマスクをコーティングする場合、この研究で使用した両方の塩堆積方法は、洗濯後にマスク上の保護塩層を更新するための家庭用に適用できます。 Spr S10 および Dip No Dil コーティングで観察されたように、マスクが硬くなり快適性が低下する過剰な塩分を避けながら、抗ウイルス活性の閾値に達するまで十分に濃縮された塩溶液を使用することに特に注意を払う必要があります。 しかし、再利用可能なフェイスマスクを製造するための材料を選択するための重要なパラメータである通気性と粒子濾過特性10は、本研究で使用される塩の量の範囲内ではおそらく塩コーティングの影響をほとんど受けず、以前に大きな孔で実証されたように、近い濃度の NaCl、KCl、または K2SO431 でコーティングされたポリプロピレン膜。 ハンドソープなどの簡単に購入できる界面活性剤は、Tween43 に実質的に置き換わる可能性があります。 すぐに使用できる塩水噴霧溶液は、適切な塩の結晶サイズと分布を備えた最適な塩コーティングを実現するための便利なオプションとなる可能性があります。 最近、10% 塩水噴霧溶液装置のテストが成功しました 35。

試験材料は、ポリエステル 80% とナイロン 20% で作られた万能マイクロファイバー不織布 (JEMAKO Pro Cloth Plus、Jemako、レーデ、ドイツ) でした。 この材料は小売店で広く入手可能であり、優れた粒子濾過特性と通気性を示します9,10,44。

塩溶液は、脱イオン水中の 29.03% w/v (29.03 g/100 mL) NaCl (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) と 1.0% v/v (1 mL/100 mL) Tween-20 (Merck) で構成されていました。 Quanらによって報告されている20。 塩溶液は、非希釈形態と希釈形態(脱イオン水で 5 倍または 10 倍希釈)でテストされました。 疎水性ポリエステル繊維を適切に湿らせるために、非イオン性界面活性剤である Tween-20 が塩溶液に添加されました 20。 Tween-20 の効果を評価するために、脱イオン水中の Tween-20 の 1.0% v/v (1 mL/100 mL) 溶液を調製しました。

スプレーと浸漬という 2 つの自動コーティング手順を使用しました。 スプレーコーティングの堆積は、自動ロボット(JR2304、ジャノメ、東京、日本)に取り付けられたミニスプレーバルブ(EFD 781、ノードソン、ウェストレイク、オハイオ州、米国)を使用して達成されました。 このシステムでは、堆積速度 (40 mm/s に設定)、スプレーヘッドと基材間の距離 (40 mm に設定)、スプレーに加えられる圧力などのパラメーターを調整することで、堆積する塩の総量を制御することができました。食塩水を含むカートリッジ (0.4 bar に設定)。 蒸着パターンは 4 mm 間隔の平行な直線で構成されていました。 ストローク (流れを制御するバルブの開口部) は、それぞれ Spr S1、Spr S3、Spr S5、および Spr S10 とラベル付けされた任意のストローク単位 1、3、5、および 10 で変化しました。 一定体積での希釈の効果を評価するために、ストロークユニット 3 の追加サンプルを 5 倍に希釈したコーティング溶液 (Spr S3 Dil5 ×) で調製しました。 条件ごとに 6.5 cm × 6.5 cm のサイズの試験材料 1 枚を処理しました。

浸漬コーティングは、自動浸漬コーター(KSV Nima(中型);Biolin Scientific、エスポー、フィンランド)を使用して実施した。 サイズ 2.5 × 3 cm の試験材料を条件ごとに 3 枚用意しました。 浸漬コーティングは、未希釈、5 倍希釈、10 倍希釈の 3 つの塩濃度を使用して実行されました (それぞれ、Dip No Dil、Dip Dil5 ×、Dip Dil10 × と表示)。 布地片を溶液に 3 秒間完全に浸漬し、100 mm/分の一定速度で引き上げました。 断片を垂直に吊り下げ、30分間水切りさせた。

Tween-20 の潜在的な抗ウイルス効果を評価するために、上記の噴霧装置および条件を使用して、1% Tween-20/水溶液を試験材料に噴霧しました。 スプレー ストローク 3、5、および 10 を適用し、それぞれ Tween Str3、Tween Str5、および Tween Str10 とラベル付けしました。 サンプルは、塩でコーティングされたサンプルと同じ方法で乾燥、保管、および処理されました。

コーティング後、材料を室温 (20 °C) で一晩乾燥させ、清潔な密封ビニール袋に窒素雰囲気下で保管しました。 塩でコーティングされたすべてのサンプルについて、コーティング前および乾燥後のサンプルの重量を量ることによって、堆積した塩を定量しました。 塩の結晶サイズと材料上の分布を決定するために、コーティングされたサンプルを SEM と EDX で分析しました。 プロトコルについては補足情報に記載されています。

MUCILAIR-HF ヒト気道細胞モデル (Epithelix、スイス、ジュネーブ) は、線維芽細胞と共培養された完全に成熟した機能的な 3D 気道上皮です。 MUCILAIR 上皮 (バッチ番号 HF-MP0009) は、外科的鼻ポリプレクトミーを受けた 14 人のドナー (年齢、24 ~ 58 歳、中央値 53 歳) から単離された鼻上皮細胞で再構成され、TRANSWELL インサート (Corning、Glendale) 上でヒト線維芽細胞と共培養されました。 、アリゾナ州、米国)32. 細胞サンプルを取得するためのすべての実験手順は完全に説明され、すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提出しました。 この研究は生物医学研究に関するヘルシンキ宣言(1989年香港修正)に従って実施され、研究計画は地元の倫理委員会によって承認された。 成熟培養物 (66 日齢) を抗ウイルス実験に使用しました。 細胞培養物は、補足情報に記載されているように、使用前に品質検査されました。

A/H3N2 ウイルス粒子は、もともと臨床検体から MUCILAIR 上皮上で直接分離され 33、系統 A/Switzerland/8004462/2013(H3N2) は、PCR、赤血球凝集阻害アッセイ、およびノイラミニダーゼ遺伝子の部分配列決定によって同定されました。 この分離株のストックは、培養培地で頂端洗浄液を収集することによって MUCILAIR 培養で生成され、感染実験で成功裏に使用されました 32,33。 完全な製造手順は補足情報に記載されています。

ウイルスに暴露する直前に、コーティングされた材料を室温(相対湿度 26%)でバッグから取り出し、ハサミを使用して 1 cm2 の小片に切り、滅菌ペトリ皿に置きました。 すべての操作は清潔で乾燥した環境で実行されました。 さらに、コーティングされていない材料の 1 cm 2 片を対照サンプルとして準備しました。 布片の両面を、UV900 G30T8 ランプ (12.0 W で 100 時間、Philips Lighting、Lamotte-Beuvron、フランス) を使用して 30 分間、C 紫外線で滅菌しました。

ウイルス接種の前に、MUCILAIR 上皮インサートを 500 μL/ウェルの MUCILAIR 培地を含む 24 ウェル プレートに置き、200 μL の MUCILAIR 培地で 34 °C で 10 分間洗浄しました。 コーティング条件ごとに 3 片の試験材料と、それぞれ 1 cm2 のサイズの 5 片の非コーティング材料を、24 ウェル プレート (CORNING COSTAR 3526; Corning, NY, USA) の別々のウェルに配置しました。 ウイルスストックから、2 × 108 ゲノムコピーを含む溶液を MUCILAIR 培地で調製しました。 5マイクロリットルのA/H3N2調製物(106gc)を試験材料の各片上に堆積させた。 10 分間の直接曝露後、ウイルスを収集するための試験サンプルを含む各ウェルに 1 mL の MUCILAIR 培地を加えました。 室温で5分間インキュベートした後、ピペッティング運動により混合し、ウイルス粒子を含む培地を新しい24ウェルプレートに移し、MUCILAIR培地で1:10に希釈した。 次に、100 μL の溶液を MUCILAIR インサート上で増殖させた細胞の頂端に適用し、34 °C、5% CO2、相対湿度 100% で 3 時間感染させました。 次いで、ウイルス接種材料を廃棄し、細胞を200μLのMUCILAIR培地で3回洗浄した。 ウイルス接種後 3.5、24、72、および 144 時間で、200 μL の MUCILAIR 培地を細胞に添加し、その後 20 分間インキュベートしました (34 °C、5% CO2、および 100% 相対湿度)。 頂端洗浄液を収集し、ゲノムコピーの定量またはウイルス力価測定まで –80 °C で保存しました。 コーティングされていないサンプル (非コーティング) および直接感染した培養物 (マスクなしの対照) が対照として含まれました。 実験中の上皮の完全性は、TEER を測定することによってモニタリングされました。 未処理、非感染のMUCILAIR培養物(モック)および界面活性剤Triton X-100で処理した培養物は、TEER測定の追加のネガティブおよびポジティブコントロールとして機能しました。 MUCILAIRインサートウェル下の培地を、48hpiに1回、500μLの新鮮なMUCILAIR培地に交換した。

濃度 0.9%、3.5%、および 35% の塩溶液を脱塩水で調製しました。 106 ゲノムコピーを含む A/H3N2 ウイルス溶液 (5 μL) を MUCILAIR 培地 (対照培地) またはさまざまな生理食塩水で 1:1 に希釈し、室温で 10 分間インキュベートしました。 ウイルスを含む対照培地および生理食塩水をMUCILAIR培地で1:10に希釈し、100μLの希釈液をMUCILAIRインサート(n=3)の先端に接種し、3時間感染させた。 感染後 3.5、24、72、および 144 時間後にウイルスを収集し、定量化しました。 実験中の上皮の完全性は、TEER を測定することによってモニタリングされました。

MUCILAIR 上皮の完全性は、感染後 24、72、および 144 時間後に TEER32、33 (EVOMX ボルトオームメーター、World Precision Instruments、スティーブニッジ、英国) を測定することによって評価されました。

ウイルス複製は、TAQMAN (ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) プローブ RT-qPCR を使用したゲノムコピーの定量化によって、感染後 3.5、24、72、および 144 時間で評価されました。 どちらの方法も補足情報で説明されています。

ウイルス滴定には MDCK-SIAT1 細胞 (Merck) を使用しました。 この細胞株は、6結合シアル酸を過剰発現するヒト α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ (SIAT1) をコードする cDNA を MDCK 細胞に安定にトランスフェクションすることで確立されました 45。 細胞は、10% (v/v) ウシ胎児血清 (2-01F16-I; BioConcept Ltd、アルシュヴィル/バーゼル、スイス)、1% 非必須アミノ酸(10,938,025; Life Technologies、ThermoFisher Scientific)、および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン(15,140,​​122; Life Technologies、ThermoFisher Scientific)。 無血清感染培地はダルベッコ改変イーグル培地中の 1% ペニシリン - ストレプトマイシンであり、アッセイ培地は 1 μg/mL トリプシン (T1426; Merck) を補充した無血清培地でした。 培養物は 5% CO2 雰囲気下、37 °C で維持されました。 コンフルエントな単層をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、無血清培地を添加した。 細胞には、ウイルス溶液の 10 倍段階希釈液を 4 つずつ接種し、感染のために 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 次に、接種材料を吸引し、アッセイ培地を添加し、細胞を 37 °C でインキュベートしました。 感染の4日後、単層からの死んだ細胞の剥離として見える細胞変性効果の存在が光学顕微鏡下で観察され、定量化された。 感染後 72 時間で収集した A/H3N2 感染 MUCILAIR 鼻上皮の頂端洗浄液を、以下の試験条件でのウイルス滴定とゲノムコピーの定量に使用しました:Spr S1、Spr S3、Spr S10、Dip Dil10 ×、コントロールなしマスク、ノンコーティング、Tween Str3。 ウイルス力価は、Reed および Muench46 のエンドポイント法によって決定され、log10 TCID50/mL として表されました。

ゲノムコピー数とウイルス力価は対数正規分布します47、48、49。 研究計画では、いくつかの科学的に賢明な比較が計画されました。非コーティング対照におけるlog10ベースのゲノムコピー数およびウイルス力価は、ウェルチ修正を用いた2サンプルのスチューデントのt検定によって、非コーティング対照における塩およびトゥイーンコーティングされた治療と比較されました。自由度(片側R t検定関数)50. 帰無仮説は、コーティングされていないサンプルと、塩およびトゥイーンでコーティングされた処理を施したサンプルの真の平均は等しいということであり、対立仮説は、コーティングされた処理を施したサンプルの真の平均は、コーティングされていない対照の真の平均よりも小さいということでした。 P 値 < 0.05 は有意とみなされ、帰無仮説の棄却につながりました。

本研究で生成および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、この原稿の草稿を編集してくれた Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy 博士に感謝したいと思います。 マスクの材料とコーティングに関する研究は、SBX Corporation (東京) が開発したナレッジマイニングおよびテキスト分析プラットフォームである Taxila を使用して実施されました。

この研究は、Philip Morris International、Epithelix Sàrl、Center Swiss d'Electronique et de Microtechnique (CSEM) SA から資金と支援を受けました。 ProMask.CHコンソーシアムの名前で行われたこのプロジェクトは、新型コロナウイルス危機下で地元経済を支援することを目的としたコロナ緊急融資からスイスのベルン州と共同資金提供された。

Sandra Schorderet Weber、Xavier Bulliard、Rosy Bonfante などの著者も同様に貢献しました。

PMI R&D、フィリップ モリス プロダクツ SA、Quai Jeanrenaud 5、2000、ヌーシャテル、スイス

サンドラ・ショーデレット・ウェーバー、ヤン・シャン、サンドロ・シュタイナー、アレクサンドラ・ローラン、ショアイブ・マジード、ステファン・レブラン、アルカディウシュ・クツァイ、マヌエル・C・パイチュ、ジュリア・ホーエン、エイドリアン・スタン

スイス エレクトロニクス アンド マイクロテクノロジー センター (CSEM)、Rue Jaquet-Droz 1、2002、ヌーシャテル、スイス

ザビエル・ブリアール、シルヴィア・ビセリ、ラファエル・ピューギン、ミケーレ・パルミエリ

Epithelix Sàrl、Chemin des Aulx 18、1228、プラン レ ワット、ジュネーブ、スイス

ロージー・ボンファンテ & サミュエル・コンスタント

Coat-X SA、Eplatures-Grise 17、2300、ラ・ショー・ド・フォン、スイス

アンドレアス・ホッグ

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研究は SC、JH、RP、および XB によって設計されました 検査作業とデータ収集は RB、SC、XB、SB、AL、および SM によって実行されました データの分析と解釈は SC、SSW、および AS によって実行され、統計はYX 研究のロジスティクスは SS、AL、SM、XB、SL によってサポートされました。原稿の最初の草稿は SSWAS によって書かれ、SS、JH、および AK が草案版についてコメントしました。 JH、MCP、MP、AS、AH はこの作業を支援し、資金を提供しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

サンドラ・ショーデレット・ウェーバーへの通信。

著者の SSW、YX、SS、AL、SM、SL、AK、MCP、JH、および AS は、フィリップ モリス インターナショナルの従業員です。 著者の SC および RB は Epithelix Sàrl の従業員であり、著者の XB、SB、RP、および MP は CSEM SA の従業員です。 著者の AH は Coat-X SA の従業員です。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Schorderet Weber, S.、Bulliard, X.、Bonfante, R. 他再利用可能なフェイスマスクの潜在的な抗ウイルス剤としての布地への塩コーティングの in vitro テスト。 Sci Rep 12、17041 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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受信日: 2022 年 4 月 11 日

受理日: 2022 年 9 月 27 日

公開日: 2022 年 10 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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